Elektroforese – Løs en kriminalgåde med DNA
Bliv klogere på hvad er elektroforese er og hvad det kan bruges til. I denne guide kan du også finde inspiration til at lave forsøg med elektroforese i undervisningen i biologi og bioteknologi.
Guide til DNA-gelelektroforese
Elektroforese bliver kort sagt brugt til at adskille og visualisere molekyler som DNA, RNA og proteiner. Her kan du lære om de basale principper i gelelektroforese og blive guidet igennem et forsøg med forsøgskittet ”DNA Fingerprinting I”, som indeholder de nødvendige prøver og buffere. Forsøgskittet består af farvede DNA-prøver fra et gerningssted og fra mistænkte, som er blevet kløvet med to forskellige restriktionsenzymer (Digest 1 og Digest 2). Eleverne får mulighed for at analysere prøver af DNA og løse en kriminalgåde, ved at finde frem til hvem der har begået forbrydelsen.
Materialer
- Forsøgskittet ”DNA Fingerprinting I”
eller andre forsøgskit til elektroforese med DNA prøver, størrelsesmarkør, buffer og farve - Agarose
- Demineraliseret vand
- Elektroforeseapparat
- Strømforsyning
- UV-transilluminator
- Mikrocentrifuge
- Mikropipetter
- Pipettespidser
- Vandbad
- Mikroovn eller kogeplade
- Laboratorie glasvarer
- Vægt
Fremgangsmåde
- Fortynd 50x bufferen med destilleret vand til 1x buffer
- Lav en 0,8% agarosegel ved at blande agarose med 1x buffer i en 250 ml standflaske. Se mængder i Tabel 1
- Smelt agarosen i mikroovnen eller på en kogeplade. Tip: Løsn låget på flasken for at undgå, at det koger over. Tag flasken ud undervejs og slyng indholdet forsigtigt. Fortsæt indtil al agarosen er smeltet
- Lad gelen køle til cirka 60 grader og fortsæt imens til step 5. Tip: Det er under 60 grader, når du kan holde på flasken i 10 sekunder uden at brænde dig
- Saml elektroforeseapparatet. Sæt endestykkerne i hver ende af gelen og placer kammen til brøndene i toppen af gelen
- Hæld forsigtigt den 60 grader varme agarose ned i gelkammeret i elektroforeseapparatet. Lad det størkne. Tip: Det tager cirka 20 minutter, og gelen bliver mindre gennemsigtig
- Fjern forsigtigt kammen og endestykkerne
- Fyld 1x buffer i elektroforeseapparatet, så det dækker gelen
- Load dine prøver (35-38 µL) i hver sin brønd i samme rækkefølgen A → F. Se tabel 2
- Luk elektroforeseapparatet. Tilslut ledninger til elektroforeseapparatet og en strømforsyning. Sørg for at den røde ledning kommer i de røde indgange, og den sorte ledning kommer i de sorte indgange
- Tænd for strømmen på 100 V. Lad elektroforesen køre i cirka 20-30 minutter
- Tag gelen op og aflæs resultaterne ved at sammenligne placeringen af DNA-stykkerne fra de mistænkte med DNA-stykkerne fra gerningsstedet
| Størrelse på gel (cm) | 1x buffer (mL) | Agarose (g) |
| 7 x 7 | 30 | 0,23 |
| 7 x 10 | 50 | 0,39 |
| 7 x 14 | 60 | 0,46 |
Tabel 1. Blandingsforhold i 0,8 % agarosegeler af forskellige størrelser.
| Brønd | Prøve | Indhold |
| 1 | A |
DNA fra gerningsstedet. Digest 1 |
| 2 | B |
DNA fra gerningsstedet. Digest 2 |
| 3 | C |
DNA fra mistænkt 1. Digest 1 |
| 4 | D |
DNA fra mistænkt 1. Digest 2 |
| 5 | E |
DNA fra mistænkt 2. Digest 1 |
| 6 | F |
DNA fra mistænkt 2. Digest 2 |
Tabel 2. Oversigt over prøverne. Digest 1 indikerer at DNA er kløvet med restriktionsenzym 1. Digest 2 indikerer at DNA er kløvet med restriktionsenzym 2.
Hvad er elektroforese og PCR?
Elektroforese er en metode, som bruges til at adskille molekyler som DNA, RNA og proteiner efter størrelse og/eller ladning. Elektroforese kaldes også for gelelektroforese, da molekylerne bliver adskilt i en gennemsigtig gel, som er støbt af agarose. Elektroforese kræver en stor mængde DNA. Derfor bliver det tit brugt sammen med PCR, som er en metode der kan kopiere stykker af DNA. Her bliver der brugt små DNA-stykker kaldet primere, som binder rundt om den DNA-sekvens, som man vil kopiere. Under PCR bliver DNA-sekvensen mellem primerne kopieret så mange gange, at der dannes store mængder af DNA.
Hvad er princippet bag elektroforese?
Ved gelelektroforese placeres prøver med for eksempel DNA i en brønd (fordybning) i toppen af en gel. DNA er opbygget af et skelet af fosfatgrupper, som gør DNA negativt ladet. Ved at tilslutte en elektrisk spændingsforskel over gelen, dannes der en positiv pol i bunden af gelen og en negativ pol i toppen af gelen. Spændingsforskellen trækker DNA-molekylerne ned igennem gelen imod den positive pol. DNA-molekylerne bliver adskilt på vejen igennem gelen, da de små molekyler nemt kan smutte igennem hulrummene i gelen, imens de store molekyler bevæger sig langsommere. Efter 20-30 minutter er DNA-molekylerne adskilt efter størrelse og er placeret i bånd. DNA’et kan gøres synligt ved at der er tilsat en farve, som bliver synlig under UV-lys. I nogle tilfælde er det godt at have en størrelsesmarkør med. En størrelsesmarkør indeholder DNA-molekyler af kendte størrelser, som kan bruges til at bestemme størrelserne af DNA-molekylerne i prøverne ved sammenligning af placeringen i gelen.
Hvordan læser man resultaterne fra gelelektroforese?
Når gelen har kørt, er DNA-molekylerne blevet adskilt efter størrelse og er synlige, som adskilte bånd. Ved at sammenligne placeringen af DNA-stykkerne med en kendt størrelsesmarkør kan du bestemme hvilke størrelse DNA-stykkerne i din prøve har. Hvis du laver et forsøg, som for eksempel ”DNA Fingerprinting I”, sammenlignes størrelsen på båndene fra gerningsstedet med båndene fra de mistænkte for at finde frem til, hvilken mistænkt der var til stede og efterlod DNA på gerningsstedet.
Hvad kan man bruge elektroforese til?
Elektroforese bliver brugt mange steder i samfundet. Ligesom forsøget i denne guide, bliver det brugt til at finde frem til en gerningsmand ud fra DNA-prøver taget fra gerningsstedet. Samme princip bliver også brugt til faderskabsbestemmelse, hvor barnets DNA sammenlignes med DNA fra mænd, der kunne være faderen. Hvis der er et match i DNA’et, kan man finde frem til barnets fader. I sygehusvæsenet bliver det blandt andet brugt til at lede efter genetiske sygdomme og infektioner. Her kan man se om personer har et bestemte gen, som er karakteristisk for genetiske sygdomme. For at finde infektioner, kan man undersøge om der f.eks. er DNA fra influenzavirus til stedet fra en prøve lægen har taget, når man er syg. Elektroforese bruges også i forskning og biotekindustrien, hvor det blandt andet bruges under genmodificering. Genmodificering er en metode, hvor DNA for eksempel i form af et plasmid fra en bakterie kan oprenses, åbnes og et nyt gen indsættes inden det igen sættes ind i bakterien. Her bruges elektroforese til at vise om plasmidet er blevet åbnet, og senere om det nye gen er blevet indsat i plasmidet og om plasmidet er kommet tilbage i bakterien.
